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Resumen.
1. Introducción.
2. Material y Métodos.
     2.1. Análisis del semen.
     2.2. Calidad de movimiento espermático.
     2.3. Congelación del semen.
     2.4. Descongelación del semen.
     2.5. Capacitación in vitro de los espermatozoides.
     2.6. Transporte de ovarios y obtención de ovocitos.
     2.7. Maduración in vitro de los ovocitos.
     2.8. Fecundación in vitro.
     2.9. Fijación y tinción de los ovocitos.
     2.10. Valoración de la fecundación in vitro.
     2.11. Análisis estadístico.
3. Resultados.
4. Discusión.
5. Bibliografía.

RESUMEN.

 Se valoró la capacidad fecundante in vitro de los espermatozoides de verraco congelados en pajillas de 0.5 y 5 ml. Los mejores resultados de fecundación in vitro (FIV) monospérmica se obtuvieron con los espermatozoides congelados-descongelados en pajillas de 5 ml. Sin embargo, no se encontró diferencia (P>0.05) entre los dos tipos de envases utilizados en cuanto a los porcentajes de polispermia y penetración. Estos resultados son prometedores para el uso futuro del semen de verraco congelado descongelado en la inseminación artificial.

1. INTRODUCCIÓN.

La utilización práctica de semen congelado de verraco es aún reducida (Córdova, 2002; Peláez et al., 2002a; Córdova et al., 2004). Su uso se ha limitado principalmente por la baja supervivencia espermática (30-40%) y a una fertilidad menor, comparadas con lo que se ha obtenido con la utilización de semen fresco (Gilmore et al., 1998; Peláez et al., 2002a).

Con la congelación del semen de verraco podría disponerse de mejores opciones para el mejoramiento del manejo reproductivo en la especie porcina. La tecnología de la congelación del semen de verraco representa una alternativa, entre cuyas cualidades se encuentran: a) establecimiento de bancos de semen congelado de razas o líneas con características zootécnicas de importancia económica, que garanticen la disponibilidad de material germinal en el momento que se requiera, b) disponer de material germinal de machos probados genéticamente, aun cuando el animal ya no exista, c) superar ciertas restricciones intencionales de transporte de animales vivos, por el problema de transmisión de enfermedades, y d) superar las limitantes de tiempo de viabilidad del semen fresco diluido (Peláez et al., 2002b; Roca et al., 2002).

Se han realizado muchos intentos para entender y evitar las condiciones perjudiciales potenciales durante la criopreservación reduciendo la cantidad total de hielo formado o evitando su formación. Una hipótesis implícita es que las condiciones que conducen a la formación de hielo en el interior de la célula es inevitablemente letal; por lo tanto, la congelación exitosa debe evitar esas condiciones. Esto ha resultado de la falta de información sobre los mecanismos por los cuales se forma hielo en las células vivas y la naturaleza de su daño (Muldrew y McGann, 1990; Córdova et al., 2002; Peláez et al., 2002c).

La forma de almacenamiento de los espermatozoides en congelación se conoce como geometría de congelación. Se cree que influye en la transferencia de la temperatura y la viabilidad espermática durante el proceso de congelación descongelación (Weitze et al., 1988; Peláez et al., 2002c). Las pajillas más utilizadas son las de 5 ml; sin embargo, presentan cierto problema criobiológico, tales como la velocidad de enfriamiento y descongelación, las cuales pueden variar a través de la pajilla misma, entre la parte periférica y central (Bwanga, 1990; Hofmo y Amlid, 1991; Peláez et al., 2002c).

El objetivo de este trabajo fue evaluar el efecto de la congelación-descongelación del semen de verraco en pajillas de 0.5 y 5 ml sobre la capacidad de fecundación in vitro (FIV) de los espermatozoides.

2. MATERIAL Y MÉTODOS.

Todos los medios utilizados en la capacitación, maduración in vitro de los ovocitos y FIV fueron obtenidos de Sigma Chemical Co., St, Louis, Missouri. El semen se extrajo de tres machos diferentes. Solamente se consideraron muestras de eyaculados con motilidad en fresco mayores de 80% y 4 de calidad en el movimiento, y 80% de integridad acrosomal (NAR).

Las variables de estudio se evaluaron por triplicado con el siguiente procedimiento:

2.1. Análisis de semen.

El semen fue evaluado inmediatamente después de la recolección del eyaculado. El volumen se midió con una probeta graduada en ml. La motilidad se analizó colocando una gota de la muestra sobre un portaobjetos previamente calentado en una platina térmica, cuya temperatura fue de 42°C con un cubreobjeto, y se observó al microscopio a 20 y 40X. Los resultados se expresaron en porcentaje, de 0 a 100.

La concentración de espermatozoides/ml se analizó con una cámara de Bürker según el método mencionado por Martín Rillo (1989); para ello se tomó una muestra de semen de 1 ml y se diluyó en 100 ml de una solución formolada al 3%.

El porcentaje de acrosomas normales (NAR), se analizó mediante la técnica indicada por Martín Rillo et al. (1996). En una gota de semen diluido en 1 ml de solución de citrato de formol al 3%, los espermatozoides fueron observados al microscopio con el objetivo de inmersión, 100X, se analizaron 100 espermatozoides por muestra. Solamente se utilizaron las muestras cuya motilidad en fresco fue mayor a 80% y 70-80% de NAR.

2.2. Calidad de movimiento espermático.

La calidad del movimiento espermático fue evaluado según la escala siguiente:

0. No se observa ningún movimiento espermático.
1. Existe movimiento pero no es progresivo.
2. Movimientos progresivos en un número bajo de espermatozoides y el resto con 3 movimientos anormales.
3. Movimientos progresivos.
4. Movimientos progresivos y rápidos.
5. Movimientos muy rápidos.

2.3. Congelación del semen.

La congelación del semen se realizó con base en el método descrito por Westendorf et al. (1975), en pajillas de 0.5 y 5 ml.

2.4. Descongelación del semen.

Las pajillas de 0.5 se descongelaron en baño María a 42ºC durante 12 segundos, y las de 5 ml a 50ºC durante 40 segundos. Después de la descongelación, se analizó la motilidad y NAR.

2.5. Capacitación in vitro de los espermatozoides.

La capacitación espermática se realizó en medio de capacitación in vitro TALP-hepes (Córdova et al., 1997). El semen fue centrifugado a 500g durante 10 minutos para retirar el plasma seminal en el fresco y los componentes de congelación en el descongelado. Los espermatozoides procedentes de semen fresco y descongelado se capacitaron en 2.5 y 1.5 horas respectivamente.

2.6. Transporte de ovarios y obtención de ovocitos.

Los ovarios para la obtención de ovocitos se transportaron al laboratorio en un termo con 200 ml de suero fisiológico estéril a una temperatura de 35°C (Abeydeera y Day, 1997a y b) con 50 mg/ml de sulfato de gentamicina (Córdova et al., 1997) en un tiempo de 1 a 1.5 hora. Los ovarios fueron lavados dos veces con suero fisiológico estéril. Los ovocitos fueron recolectados de folículos de 3-6 mm de diámetro por aspiración, mediante una jeringa estéril de 5 ml y una aguja de 18GX de acuerdo con Ka et al. (1997). El líquido folicular se depositó en tubos de centrífuga de punta cónica y se dejó en reposo durante 10 minutos, se retiró el sobrenadante con pipeta Pasteur y el paquete de ovocitos se resuspendió en medio TCM 199. La suspensión de ovocitos se colocó en caja de petri y se observó al microscopio estereoscópico para su recolección y selección. Se colocaron en placas estériles de cuatro pocillos para lavarlos, en gotas de 250 ml medio TCM 199.

2.7. Maduración in vitro de los ovocitos.

Los ovocitos seleccionados se colocaron en placas estériles de cuatro pocillos con 100 ml de medio TCM-199 enriquecido con 2 UI/ml de pergonal (FSH y LH, Serono México) y 1 ml de b-estradiol a 38° en condiciones de humedad y 5% de CO² durante 44 horas.

2.8. Fecundación in vitro.

Los ovocitos libres de células del cúmulo se depositaron en placas estériles de cuatro pocillos con gotas de 100 ml de medio TCN-199 enriquecido con 10% de suero fetal bovino inactivado, 1mg/ml de glucosa, 0.25mM de piruvato de sodio, 10mg/ml de gentamicina y 1mg/ml de b-estradiol ajustado a una presión osmótica de 280 a 290 mOsm/kg, inmersos en aceite mineral. Se incubaron a 38°C en condiciones de humedad y 5% de CO². Posteriormente, se coincubaron con los espermatozoides a una concentración de 5 x 104 espermatozoides/ml, se colocaron de 30-40 ovocitos por placa (Córdova et al., 1997) durante 12 horas (Abeydeera y Day, 1997a y b).

2.9. Fijación y tinción de los ovocitos.

Los ovocitos fueron fijados en metanol y ácido acétrico a la proproción de 3:1 durante 24 horas (Abeydeera y Day, 1997a y b).

2.10. Valoración de la fecundación in vitro.

Los ovocitos fueron teñidos con orceína acética al 2% y se evaluaron monospérmicos, plispérmicos y penetrados, considerando la formación de pronúcleo.

2.11. Análisis estadístico.

Los datos fueron tratados mediante análisis de varianza para medidas repetidas y test de comparaciones múltiples, con el uso del software SAS (sistema de análisis estadístico) (SAS/STAT, 1997). Se consideró diferencia significativa para una probabilidad P<0.05. Para preservar el nivel de significación general en los tests de comparaciones múltiples, se penalizó el nivel de significación de cada test individual dividiéndolo por el número de comparaciones realizadas.

3. RESULTADOS.

El cuadro 1 presenta los resultados obtenidos de monospermia (FIV), polispermia y penetración.

4. DISCUSIÓN.

En este trabajo se aprecia el efecto de la congelación del semen de verraco en pajillas de 0.5 y 5 ml sobre la capacidad de FIV de los espermatozoides, donde la penetración espermática, la polispermia, la motilidad y NAR se reducen de igual manera. Sin embargo, se afectan más los porcentajes de monospermia con semen procedente de pajillas de 0.5 ml.

Por otro lado, se observa que el semen congelado en pajillas de 5 ml afecta menos las características de FIV de los espermatozoides que el almacenado en pajillas de 0.5 ml, datos que concuerdan con los reportados por Torreta et al. (1996).

En años recientes, se ha indagado la posibilidad de congelar el semen de verraco en bolsas de plástico de pared delgada con volumen de 5 ml, lo cual pretende superar los problemas criobiológicos y prácticos existentes con los envases hasta la fecha utilizados (Rodríguez Martínez et al., 1996; Peláez et al., 2002a). No obstante, aunque su uso puede ser factible, todavía presentan problemas de almacenamiento y descongelación.

Los mejores resultados de FIV monospérmica se obtuvieron con los espermatozoides congelados-descongelados en pajillas de 5 ml. Estos datos contrastan con los obtenidos por Rodríguez Martínez et al. (1996), quienes indicaron que los volúmenes más pequeños son mejores en cuanto a la supervivencia de los espermatozoides descongelados. Sin embargo, en este trabajo no se encontró diferencia entre los dos tipos de pajillas para polispermia y penetración.

En conclusión, los resultados obtenidos en este trabajo de FIV monospérmica son prometedores para el uso futuro la inseminación artificial de la especie porcina con semen congelado-descongelado en pajillas de 5 ml.

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